Enzymatic Acivity


 

   Table 1. Enzyme assay reaction were prepared according below table. After adding 0,1%SDS mixture were vortex at 28℃ for 5 minutes. Incubation of tubes occurs at 28℃ for 15 minutes. After adding 1M Na2COmixture was vortex. After all reaction mixture were centrifuged and debris was discarded. Remaining part taken as 200 μl was added into well plate from F1 to F7 with respectively. Spectrophotometric measurements were applied at 420 nm. 

Z Buffer ‘s 

pH 

 4  5  6  7  8  9  10  
Cell lysate  800μl  800μl  800μl  800μl  800μl  800μl  800μl 
Z buffer  500μl  500μl  500μl  500μl  500μl  500μl  500μl 
Chloroform  100μl  100μl  100μl  100μl  100μl  100μl  100μl 
0,1% SDS  50μl  50μl  50μl  50μl  50μl  50μl  50μl 
Vortex 1               
4mg/ml 

ONPG 

200μl  200μl  200μl  200μl  200μl  200μl  200μl 
Incubation               
1M Na2CO3  300μl  300μl  300μl  300μl  300μl  300μl  300μl 
Vortex 2               

 

Temperature: 

Table 2. Enzyme assay reaction were prepared according below table. After adding 0,1%SDS mixture were vortex at 28℃ for 5 minutes. Each tube incubated at different temperatures from -20℃ to 90℃ for 15 minutes. After adding 1M Na2COmixture was vortex. After that, all reaction mixture were centrifuged and debris was discarded. Remaining part taken as 200 μl was added into well plate from G1 to G8 with respectively.Spectrophotometric measurements were applied at 420 nm. 

 

Temperature  -20℃  4℃  10℃  23℃  30℃  40℃  60 ℃  90℃ 
Cell lysate  800μl  800μl  800μl  800μl  800μl  800μl  800μl  800μl 
Z buffer 

(pH 7) 

500μl  500μl  500μl  500μl  500μl  500μl  500μl  500μl 
Chloroform  100μl  100μl  100μl  100μl  100μl  100μl  100μl  100μl 
0,1% SDS  50μl  50μl  50μl  50μl  50μl  50μl  50μl  50μl 
Vortex 1                 
4mg/ml 

ONPG 

200μl  200μl  200μl  200μl  200μl  200μl  200μl  200μl 
Incubation                 
1M Na2CO3  300μl  300μl  300μl  300μl  300μl  300μl  300μl  300μl 
Vortex 2                 

 

Glucose inhibitor: 

Table 3. Enzyme assay reaction were prepared according below table. After adding 0,1%SDS mixture were vortex at 28℃ for 5 minutes. Incubation of tubes occurs at 28℃ for 15 minutes. After adding 1M Na2COmixture was vortex. After all reaction mixture were centrifuged and debris was discarded. Remaining part taken as 200 μl was added into well plate from E1 to E7 with respectively.E1 was contain only diluted cell.Spectrophotometric measurements were applied at 420 nm. 

Glucose  

Concentration 

25mM  50mM  75 mM  100mM  200mM  500mM 
Cell lysate  800μl  800μl  800μl  800μl  800μl  800μl 
Z buffer  487.5μl  475μl  462.5μl  450μl  400μl  250μl 
Chloroform  100μl  100μl  100μl  100μl  100μl  100μl 
0,1% SDS  50μl  50μl  50μl  50μl  50μl  50μl 
Vortex 1             
Glucose   12.5μl  25μl  37.5μl  50μl  100μl  250μl 
4mg/ml 

ONPG 

200μl  200μl  200μl  200μl  200μl  200μl 
Incubation             
1M Na2CO3  300μl  300μl  300μl  300μl  300μl  300μl 
Vortex 2             

Table 4. Enzyme assay reaction were prepared according below table. After adding 0,1%SDS mixture were vortex at 28℃ for 5 minutes. Incubation of tubes occurs at 28℃ for 15 minutes. After adding 1M Na2COmixture was vortex. After all reaction mixture were centrifuged and debris was discarded. Remaining part taken as 200 μl was added into well plate from H2 to E5 with respectively.H1 contains blank mixture.Spectrophotometric measurements were applied at 420 nm. 

EDTA  

Concentration 

5mM  10mM  50 mM  100mM 
Cell lysate  800μl  800μl  800μl  800μl 
Z buffer  495μl  490μl  450μl  400μl 
Chloroform  100μl  100μl  100μl  100μl 
0,1% SDS  50μl  50μl  50μl  50μl 
Vortex 1         
EDTA  5μl  10μl  50μl  100μl 
4mg/ml 

ONPG 

200μl  200μl  200μl  200μl 
Incubation         
1M Na2CO3  300μl  300μl  300μl  300μl 
Vortex 2         

 

Results: 

 

Graph 1. shows enzyme activity due to increasing glucose concentration. Enzyme activity shown as Miller Units and concentration was mM unit. 

 

Graph 2. shows enzyme activity due to increasing pH concentration.   

 

 

Graph 3. shows enzyme activity due to increasing temperature. 

 

Graph 4. shows enzyme activity due to increasing EDTA concentration. 

All MU calculations were obtained by using given formula.  

Miller Units Equation:         
MU=1000x(OD420)/TxVxOD600  T= 15 minutes  V =0,8ml  OD600nm=0,884  OD420=Obtained absorbance 

 

Glucose mM  Miller Units  OD420  Miller Units Calculation 
25  30,82  0,327  MU=1000x(0,327)/15×0,8×0,884 
50  37,9  0,402  MU=1000x(0,402)/15×0,8×0,884 
75  42,42  0,45  MU=1000x(0,450)/15×0,8×0,884 
100  38,08  0,404  MU=1000x(0,404)/15×0,8×0,884 
200  37,61  0,399  MU=1000x(0,399)/15×0,8×0,884 
500  32,71  0,347  MU=1000x(0,347)/15×0,8×0,884 

 

pH  Miller Units  logMU  OD420  Miller Units Calculation 
4  32,14  1,507046  0,341  MU=1000x(0,341)/15×0,8×0,884 
5  34,4  1,536558  0,365  MU=1000x(0,365)/15×0,8×0,884 
6  77,5  1,889302  0,822  MU=1000x(0,822)/15×0,8×0,884 
7  80,5  1,905796  0,854  MU=1000x(0,854)/15×0,8×0,884 
8  84,93  1,929061  0,901  MU=1000x(0,901)/15×0,8×0,884 
9  60,05  1,778513  0,637  MU=1000x(0,637)/15×0,8×0,884 
10  69,85  1,844166  0,741  MU=1000x(0,741)/15×0,8×0,884 

 

Temperature  Miller Units  OD420  Miller Units Calculation 
-20  32,05  0,34  MU=1000x(0,34)/15×0,8×0,884 
4  42,8  0,454  MU=1000x(0,454)/15×0,8×0,884 
23  76,26  0,809  MU=1000x(0,809)/15×0,8×0,884 
30    0,616  Not accepted 
40  79,75  0,846  MU=1000x(0,846)/15×0,8×0,884 
60  16,87  0,179  MU=1000x(0,179)/15×0,8×0,884 
90    2,274  Not accepted 

 

EDTA mM  Miller Units  OD420  Miller Units Calculation 
5  17,06  0,181  MU=1000x(0,181)/15×0,8×0,884 
10  10,18  0,108  MU=1000x(0,108)/15×0,8×0,884 
20  4,05  0,043  MU=1000x(0,043)/15×0,8×0,884 
100  1,7  0,018  MU=1000x(0,018)/15×0,8×0,884 

 

Discussion: 

In this experiment enzyme activity was observed in different temperatures, pH and concentration of inhibitors. Main of this experiment was to investigate change in the enzyme activities due to those differences. EDTA could affect irreversible of the enzyme activity because activity of and enzyme reach almost zero level over time. In glucose inhibition even though it decrease the activity of an enzyme, there was not great difference from initial to last. Vmax and Km could not be compared because there was not any difference in substrate concentration. To investigate this difference  other sample with different concentration of ONPG could be prepared and then compared with those. Temperature and pH graphs shows parabolic lines that was expected. In both cases enzyme activity would not reach zero. Optimum pH seen as between 6-8 from graph. Optimum temperature seen as approximately 40 ℃. Optimum pH and temperature was important because at those levels enzyme would be work with highest efficiency.  

References: 

  1. https://www.chem.wisc.edu/deptfiles/genchem/netorial/modules/biomolecules/modules/enzymes/enzyme5.htm 
  1. https://www.chem.uwec.edu/webpapers2006/sites/gartonrd/amanitin/amanitin.html 
  1. https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/uncompetitive-inhibitor 
  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1658998 
  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22530/ 
  1. http://www.pnas.org/content/88/10/4210.short 

 

 

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.