Enzymes


Table 1. Substrate preparation were done by applying indicated amounts of ONPG by simple dilution. Stock solution of ONPG was 15mg/ml.Then, reaction mixture were prepared by adding Z buffer, Chloroform, 0.1 % SDS by respective manner. Na2COwas added to end the reaction.Each tube contained 800 μl cell lysate.  

Substrate Concentration  Distilled water  ONPG  Assay Reaction Mix 
Z Buffer  Chloroform  0.1% SDS  Na2CO3 
15mg/ml  0 μl  300 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
12mg/ml  60 μl  240 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
10mg/ml  100 μl  200 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
7.5 mg/ml  150 μl  150 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
5 mg/ml  200 μl  100 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
4 mg/ml  220 μl  80 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
3mg/ml  240 μl  60 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
2 mg/ml  260 μl  40 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
1 mg/ml  280 μl  20 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
0.5 mg/ml  290 μl  10 μl  500 μl  100μl  50μl  300μl 
Blank      700 μl  100μl  50μl  300μl 

 Results: 

Table2. Substrate concentration obtained from M1xV1=M2xV2 formula. Needed amounts of ONPG were indicated below. 

Substrate Concentration  Calculation for substrate  Needed ONPG 
15mg/ml  15xV=15×300  300 μl 
12mg/ml  15xV=12×300  240 μl 
10mg/ml  15xV=10×300  200 μl 
7.5mg/ml  15xV=7.5×300  150 μl 
5mg/ml  15xV=5×300  100 μl 
4mg/ml  15xV=4×300  80 μl 
3mg/ml  15xV=3×300  60 μl 
2mg/ml  15xV=2×300  40 μl 
1mg/ml  15xV=1×300  20 μl 
0.5mg/ml  15xV=0.5×300  10 μl 

Table3.OD measurements at 420 nm for each ONPG concentration were indicated below.  

ONPG concentration (mg/ml)  OD420 
   0,5  0,2423 
1  0,5147 
2  0,8049 
3  1,1891 
4  1,3888 
5  1,3707 
7,5  1,6926 
10  1,5301 
12  1,6864 
15  1,8264 
   
Substrate  Miller Units  Calculation 
0,5  14,96  0,2423*1000/(15*0,8*1,35) 
1  32,87            0,5147*1000/(15*0,8*1,35) 
2  51,40  0,8049*1000/(15*0,8*1,35) 
3  75,93  1,1891*1000/(15*0,8*1,35) 
4  88,68  1,3888*1000/(15*0,8*1,35) 
5  87,53  1,3707*1000/(15*0,8*1,35) 
7,5  108,08  1,6926*1000/(15*0,8*1,35) 
10  97,71  1,5301*1000/(15*0,8*1,35) 
12  107,69  1,6864*1000/(15*0,8*1,35) 
15  116,63  1,8264*1000/(15*0,8*1,35) 

 Table 4. Shows Miller Unit calculations for enzyme velocity. 1000x(OD420) / TxVxOD600 that formula was applied.OD600 

was obtained as 1.305. 

Graph1 shows velocity versus substrate concentration of enzyme. Velocity’s unit was indicated as Miller unit.Expected logarithmic line added for visualized how accurate data were.Predicted vmax was seen as 120 MU. Km predicted as approximately 2 mg/ml. 

 

Table 5. shows 1/Miller Units and 1/Substrate Concentration calculations. 

1/Miller Units  1/Substrate  Calculation for 1/miller unit  Calculation for 1/ Substrate 
0,07  2  1/14,96  1/0.5 
0,03  1,00  1/32,87  1/1 
0,02  0,50  1/51,40  1/2 
0,01  0,33  1/75,93  1/3 
0,01  0,25  1/88,68  1/4 
0,01  0,20  1/87,53  1/5 
0,01  0,13  1/108,08  1/7,5 
0,01  0,10  1/97,71  1/10 
0,01  0,08  1/107,69  1/12 
0,01  0,07  116,63  1/15 

 Graph 2. Lineweaver-Burk Plot were plotted by 1/velocity versus 1/substrate concentration. 1/velocity unit is 1/MU and 1/Substrate unit is ml/mg.  

 

Km calculation  V max calculation  
For y=0    -1/Km=-0.176  Km=5.68mg/ml  From slope Km/Vmax=0.0296  Vmax=191.9 
5.68mg/mlx1g/1000mgx1mole/1/301.25×1000/1Lx1000ml/1 mole = 1.8mM  Vmax conversion : 1.8mM /(1.91 ) x1000 = 942 micromolar/min/mg 

 

Discussion: 

In this laboratory enzyme kinetics were studied by investigating β galactosidase activity. Michaelis-Menten and Lineweaver Burk plots were drawed for indicate Km and Vmax values. 

According from Michaelis-Menten graph, approximate Vmax was close to calculated Vmax from Lineweaver-Burk plot value. Expected value for Km was 0.12mM and Vmax was Expected   360μg/min/mg.(*7).However obtained Km value was greater than expected. Expected value was obtained when manganase were used as cofactor, maybe this affected the result.According from obtained result, enzyme needs more substrate to reaction occur. However, expected value shows taht less amount of substrate is needed for reaching maximum velocity. When calculated Vmax turn to related unit , Vmax seen as greater than expected value. Enzyme catalyze more faster than expected. When substrate amount not reach its expected value, velocity of an enzyme can not reach greater value. Because of their specific interactions between substrate and enzyme. Even though substrate can not increase the rate of reaction, to observe velocity enzyme and substrate must made complex. 

 

References: 

 

1.http://www.uniprot.org/uniprot/P9WKD3  
2.http://enzyme.expasy.org/EC/3.5.2.-  
3.https://www.researchgate.net/publication/268424197_Enzymes_used_in_detergents_Lipases 

 

4.http://www.uniprot.org/uniprot/O59952  
5.http://enzyme.expasy.org/EC/3.1.1.-  

 

6.http://enzyme.expasy.org/EC/3.1.21.- 

 

7.http://www.uniprot.org/uniprot/P00722 
 

 

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.